Справочная

" - 1 2 4 b N O S А Б В Г Д Е Ж З И К Л м Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э

БЕЛКИ

БЕЛКИ , высокомол. прир. полимеры, построенные из остатковаминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью —СО—NH—. Каждый белокхарактеризуется специфич. аминокислотной последовательностью и индивидуальнойпространств, структурой (конформацией). На долю белков приходится не менее50% сухой массы орг. соед. животной клетки. Функционирование белков лежит воснове важнейших процессов жизнедеятельности организма. Обмен в-в (пищеварение,дыхание и др.), мышечное сокращение, нервная проводимость и жизнь клеткив целом неразрывно связаны с активностью ферментов — высокоспецифич.катализаторовбиохим. р-ций, являющихся белками. Основу костной и соединительной тканей,шерсти, роговых образований составляют структурные белки (см., напр.,Коллаген).Ониже формируют остов клеточных органелл (митохондрий, мембран и др.). Расхождениехромосом при делении клетки, движение жгутиков, работа мышц животных ичеловека осуществляются по единому механизму при посредстве белков сократительнойсистемы (см., напр., Актин, Миозин). Важную группу составляют регуляторныебелки, контролирующие биосинтез белков и нуклеиновых к-т. К регуляторнымбелкам относятся также пептидно-белковыегормоны, к-рые секретируютсяэндокринными железами. Информация о состоянии внеш. среды, разл. регуляторныесигналы (в т. ч. гормональные) воспринимаются клеткой с помощью спец. рецепторныхбелков, располагающихся на наружной пов-сти плазматич. мембраны. Этибелки играют важную роль в передаче нервного возбуждения и в ориентированномдвижении клетки (хемотаксисе). В активном транспорте ионов, липидов, Сахарови аминокислот через биол. мембраны участвуют транспортные белки, или белки-переносчики.К последним относятся также гемоглобин и миоглобин, осуществляющиеперенос кислорода. Преобразование и утилизация энергии, поступающей в организмс питанием, а также энергии солнечного излучения происходят при участиибелков биоэнергетич. системы (напр.,родопсин, цитохромы). Большое значениеимеют пищевые и запасные белки (см., напр., Казеин, Проламины), играющиеважную роль в развитии и функционировании организмов. Защитные системывысших организмов формируются защитными белками, к к-рым относятся иммуноглобулины(ответственныза иммунитет), белки комплемента (ответственны за лизис чужеродныхклеток и активацию иммунологич. ф-ции), белки системы свертывания крови (см.,напр.,Тромбин, Фибрин) и противовирусный белок интерферон.

По составу белки делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков,и сложные. Сложные могут включать ионы металла (металлопротеиды) или пигмент(хромопротеиды), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины),нуклеиновымик-тами (нуклеопротеиды), а также ковалентно связывать остаток фосфорнойк-ты (фосфопротеиды), углевода (гликопротеины)или нуклеиновой к-ты(геномы нек-рых вирусов). В соответствии с формой молекул белки подразделяютна глобулярные и фибриллярные. Молекулы первых свернуты в компактные глобулысферич. или эллипсоидной формы, молекулы вторых образуют длинные волокна(фибриллы) и высокоасимметричны. Большинство глобулярных белков, в отличиеот фибриллярных, растворимы в воде. Особую группу составляют мембранные(амфипатические) белки, характеризующиеся неравномерным распределением гидрофильныхи гидрофобных (липофильных) участков в молекуле: погруженная в биол. мембранучасть глобулы состоит преим. из липофильных аминокислотных остатков, авыступающая из мембраны — из гидрофильных.

Историческая справка. Первые работы по выделению и изучению белковыхпрепаратов были выполнены еще в 18 в., однако в тот период исследованиябелков носили описательный характер. В нач. 19 в. были сделаны первые анализыэлементного состава белков (Ж. Л. Гей-Люссак, Л. Ж. Тенар, 1810), положившиеначало систематич. аналит. исследованиям, в результате к-рых было установлено,что все белковые в-ва близки не только по внеш. признакам и св-вам, нои по элементному составу. Важное следствие этих работ — создание первойтеории строения белковых в-в (Г.Я. Мульдер, 1836), согласно к-рой все белкисодержат общий гипотетич. радикал — "протеин", имеющий эмпирич. ф-лу C40H62N10O12и связанный в разл. пропорциях с атомами серы и фосфора. Получив вначалевсеобщее признание, эта теория привлекла интерес к аналит. исследованиямбелков, совершенствованию препаративных методов белковой химии. В этот периодбыли разработаны простейшие приемы выделения белков путем экстракции р-раминейтральных солей и осаждения, получены первые кристаллич. белки (гемоглобин,нек-рые растит. белки), для анализа белков стали использовать кислотный и щелочнойгидролиз.

Создание теории протеина совпало по времени с формированием представленийо функции белков в организме. В 1835 Й.Я. Бёрцедиус высказал идею о важнейшейф-ции белков — биокаталитической. Вскоре были открыты первые протеолитич. ферменты- пепсин (Т. Шмнн._1836) и трипсин (Л. Корвизар, 1856). Открытие протеазстимулировало интерес биохимиков к физиологии пищеварения, а следовательно,и к продуктам переваривания белков. К сер. 19 в. было показано, что под действиемпротеолитич. ферментов белки распадаются на близкие по св-вам фрагменты, получившиеназв. пептонов (К. Леман, 1850).

Важное событие в изучении белков — выделение из белкового гидролизата аминокислотыглицина (А. Браконно, 1820). К кон. 19 в. было изучено большинство аминокислот,входящих в состав белков, синтезирован аланин (А. Штреккер, 1850). В 1894 А.Косеелъ высказал идею о том, что осн. структурными элементами белков являютсяаминокислоты.

В нач. 20 в. значит. вклад в изучение белков был внесен Э. Фишером, .впервыеприменившим для этого методы орг. химии. Путем встречного синтеза Э. Фишердоказал, что белки построены из остатков/images/enc2/002355.jpgаминокислот,связанных амидной (пептидной) связью. Он также выполнил первые аминокислотныеанализы белков, дал правильное объяснение протеолизу.

В 20-40-е гг. получили развитие физ.-хим. методы анализа белков. Седиментационнымии диффузионными методами были определены мол. массы многих белков, полученыданные о сферич. форме молекул глобулярных белков (Т. Сведберг, 1926), выполненыпервые рентгеноструктурные анализы аминокислот и пептидов (Дж. Д. Бернал,1931), разработаны хроматографич. методы анализа (А. Мартин, Р. Синг, 1944).Существенно расширились представления о функциональной роли белков: был выделенпервый белковый гормон — инсулин (Ф. Бантинг, Ч. Г. Бест, 1922), антителабыли идентифицированы как фракция/images/enc2/002356.jpgглобулинов(1939) и тем самым обнаружена новая ф-ция белков — защитная. Важным этапомявилось открытие ферментативной ф-ции мышечного миозина (В. А. Энгельгардт,М.Н.Любимова, 1939) и получение первых кристаллич. ферментов (уреазы-Дж.Б.Салшер, 1926; пепсина — Дж.X. Нортроп, 1929; лизоцима — Э. П. Абрахам,Р. Робинсон, 1937).

В нач. 50-х гг. была выдвинута идея о трех уровнях организации белковыхмолекул (К. У. Линдерстрём-Ланг, 1952) — первичной, вторичной и третичнойструктурах. Определены первичные структуры инсулина (Ф. Сенгер, 1953) ирибонуклеазы (К. Анфинсен, С. Мур, К. Хёрс, У. Стайн, 1960). По даннымрентгеноструктурного анализа были построены трехмерные модели миоглобина(Дж. Кендрю, 1958) и гемоглобина (М, Перуц, 1958) и, т. обр., доказаносуществование в белках вторичной и третичной структур, в т. ч./images/enc2/002357.jpgспирали, предсказанной Л. Допингом и Р. Кори в 1949-51.

В 60-е гг. в химии белков интенсивно развивалось синтетич. направление:были синтезированы инсулин (X. Цан, 1963, П. Кадоянис, 1964, Ю. Ван и др.,1965) и рибонуклеаза А (Б. Меррифидд, 1969). Дальнейшее развитие получилианалит. методы: стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор,созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич.методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ,сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотныхостатков в белках — секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967). Благодаря созданиюпрочной методич. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотнойпоследовательности белков. В эти годы была определена структура неск. сотенсравнительно небольших белков (до 300 аминокислотных остатков в одной цепи),полученных из самых разл. источников как животного, так и растит., бактериального,вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин,химотрипсин, субтилизин, карбоксипептидазы), миоглобины, гемоглобины, цитохромы,лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, белки оболочек вирусов,белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки длярешения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др.областей физ.-хим. биологии.

В 70-80-е гг. наиб. прогресс был достигнут при изучении белков — регуляторовматричного синтеза биополимеров (в т.ч. белков рибосом), сократительных, транспортныхи защитных белков, ряда мембранных белков (в т. ч. белков биоэнергетич. систем), рецепторныхбелков. Большое внимание уделялось дальнейшему совершенствованию методов анализабелков. Значительно повышена чувствительность автоматич. анализа аминокислотнойпоследовательности белков (Б. Витман-Либольд, Л. Худ). Широкое применение нашлиновые методы разделения белков и пептидов (жидкостная хроматография высокогодавления, биоспецифич. хроматография). В связи с разработкой эффективныхметодов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам и У. Гилберт,Ф. Сенгер) стало возможным использовать полученную при таком анализе информациюи при определении первичной структуры белков. В результате установлена структураряда белков, доступных в ничтожно малых кол-вах (интерферон, ацетилхолиновыйрецептор), а также белков большой мол. массы (фактор элонгации G, гликогенфосфорилаза,/images/enc2/002358.jpgгалактозидаза,коллаген,/images/enc2/002359.jpg и/images/enc2/002360.jpgсубъединицыРНК-полимеразы, содержащие соотв. 701, 841, 1021, 1028, 1342 и 1407 аминокислотныхостатков). Успехи структурного анализа позволили вплотную приступить копределению пространств, организации и молекулярных механизмов функционированиянадмолекулярных комплексов, в т.ч. рибосом, хроматина (нуклеосом), митохондрий,фагов и вирусов. Существ, результаты получены в эти годы советскими учеными:определена первичная структура аспартатаминотрансферазы (1972), бактериородопсина(1978), животного родопсина (1982), нек-рых рибосомальных белков, фактора элонгацииG (1982), важнейшего фермента-РНК-полимеразы (1976-82), нейротоксинов идр.

Строение белковых молекул. Практически все белки построены из 20/images/enc2/002361.jpgаминокислот,принадлежащих, за исключением глицина, к L-ряду. Аминокислоты соединенымежду собой пептидными связями, образованными карбоксильной и/images/enc2/002362.jpgаминогруппамисоседних аминокислотных остатков (см. ф-лу I):
/images/enc2/002363.jpg

Белковая молекула может состоять из одной или неск. цепей, содержащихот 50 до неск. сотен (иногда — более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы,содержащие менее 50 остатков, часто относят к пептидам. В составмн. молекул входят остатки цистина, дисульфидные связи к-рых ковалентносвязывают участки одной или неск. цепей.

В нативном состоянии макромолекулы белков обладают специфич. конформацией.Характерная для данного белка конформация определяется последовательностьюаминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептиднымии боковыми группами аминокислотных остатков, а также гидрофобными и электростатич.взаимодействиями. Большое влияние на конформацию оказывают взаимод. белковс компонентами среды (вода, липиды и др.), в к-рой они функционируют.

Различают четыре уровня организации белковых молекул. Последовательностьаминокислотных остатков в полипептидной цепи наз. первичной структурой.Все белки различаются по первичной структуре; потенциально возможное их числопрактически неограничено. Термин "вторичная структура" относится к типуукладки полипептидных цепей. наиб. часто встречающиеся типы-правая/images/enc2/002364.jpgспираль и/images/enc2/002365.jpgструктура.Первая характеризуется планарностью пептидной группы; водородные связимежду СО-и NH-группами пептидной цепи замыкают циклы из 13 атомов (рис.1). На 1 виток/images/enc2/002366.jpgспиралиприходится 3,6 остатка аминокислот, шаг спирали -0,544 нм. Значительноменее энергетически выгодны правые 310- и/images/enc2/002367.jpgспирали,содержащие соотв. 3 и 4,4 аминокислотных остатка на 1 виток, а также 10и 16 атомов в циклах, образованных водородными связями. 310-Спираливстречаются сравнительно редко и образуют только очень короткие участки,к-рые обычно располагаются на концах/images/enc2/002368.jpgспиралей.Предсказанные теоретически правые/images/enc2/002369.jpgспирали,а также левые/images/enc2/002370.jpg310- и/images/enc2/002371.jpgспиралив белках не обнаружены.

В случае/images/enc2/002372.jpgструктуры,или структуры складчатого листа, полипептидные цепи растянуты, уложеныпараллельно друг другу и связаны между собой водородными связями. Остовцепи не лежит в одной плоскости, а вследствие небольших изгибов при/images/enc2/002373.jpgуглеродныхатомах образует слегка волнистый слой. Боковые группы располагаются перпендикулярноплоскости слоя. В белках обнаружены два вида/images/enc2/002374.jpgструктуры:с параллельным и антипараллельным направлениями цепей (рис. 2). Частныйслучай/images/enc2/002375.jpgструктуры-/images/enc2/002376.jpgизгиб,обеспечивающий поворот пептидной цепи на угол ок. 180° на протяжении отрезка,содержащего 4 аминокислотных остатка; 1-й и 4-й остатки соединены водороднойсвязью. Относительное содержание/images/enc2/002377.jpgспиральныхучастков и/images/enc2/002378.jpgструктур может широко варьировать. Существуют белки с преобладанием/images/enc2/002379.jpgспиралей(ок. 75% в миоглобине и гемоглобине), тогда как осн. тип структуры многихфибриллярных белков, в т.ч. фиброина шелка и кератина волос,-/images/enc2/002380.jpgструктура.У многих белков содержание/images/enc2/002381.jpgи/images/enc2/002382.jpgструктурныхучастков незначительно, однако и в этих случаях полипептидные цепи укладываютсяв пространстве строго определенным, характерным для каждого белка образом.

Под третичной структурой белков понимают расположение его полипептиднойцепи в пространстве. Существ. влияние на формирование третичной структурыоказывают размер, форма и полярность аминокислотных остатков. В молекулахглобулярных белков большая часть гидрофобных остатков скрыта внутри глобулы,а полярные группировки располагаются на ее пов-сти в гидратированном состоянии.Однако ситуация не всегда настолько проста. Связывание белка с др. молекулами,напр. фермента с его субстратом или коферментом, почти всегда осуществляетсяс помощью небольшого гидрофобного участка на пов-сти глобулы. Область контактамембранных белков с липидами формируется преим. гидрофобными остатками. Третичнаяструктура многих белков составляется из неск. компактных глобул, наз. доменами(рис. 3). Между собой домены обычно бывают связаны "тонкими перемычками"- вытянутыми полипептидными цепями. Пептидные связи, расположенные в этихцепях, расщепляются в первую очередь при обработке белков протеолитич. ферментами,тогда как отдельные домены м. б. достаточно устойчивы к протеолизу.
/images/enc2/002383.jpg

Рис. I. Спиральные конформации полипептидных цепей: а-310-спираль,б-/images/enc2/002384.jpg спираль,в-/images/enc2/002385.jpgспираль (пунктирныелинии-водородные связи).
/images/enc2/002386.jpg

Рис. 2. Схематич. изображение/images/enc2/002387.jpgструктур:слева — антипараллельный, справа — параллельный складчатый лист.
/images/enc2/002388.jpg

Рис. 3. Схематич. изображение трехмерной структуры малатде-гидрогеназы.Участки/images/enc2/002389.jpgспиралей(от/images/enc2/002390.jpg до/images/enc2/002391.jpg/images/enc2/002392.jpgструктур(от/images/enc2/002393.jpg до/images/enc2/002394.jpg)представлены соотв. в виде прямоугольников и прямых линий со стрелками.Структура состоит из двух отчетливо различимых глобулярных областей (доменов).Участок полипептидной цепи, соединяющий домены между собой, показан точечнойлинией.

Термин "четвертичная структура" относится к макромолекулам, в составк-рых входит неск. полипептидных цепей (субъединиц), не связанных междусобой ковалентно. Такая структура отражает способ объединения и расположенияэтих субъединиц в пространстве. Между собой отдельные субъединицы соединяютсяводородными, ионными, гидрофобными и др. связями. Изменение рН и ионнойсилы р-ра, повышение т-ры или обработка детергентами обычно приводят кдиссоциации макромолекулы на субъединицы. Этот процесс обратим: при устранениифакторов, вызывающих диссоциацию, может происходить самопроизвольная реконструкцияисходной четвертичной структуры. Явление носит общий характер: по принципусамосборки функционируют многие биол. структуры. Способность к самосборкесвойственна и отдельным фрагментам белков — доменам. Более глубокие измененияконформации белков с нарушением третичной структуры наз. денатурацией.

Свойства. Физ.-хим. св-ва белков определяются их высокомол. природой,компактностью укладки полипептидных цепей и взаимным расположением остатковаминокислот. Мол. масса варьирует от 5 тыс. до 1 млн., а константы седиментации- от 1 до 20 (и выше). Средний уд. объем белковых молекул — 0,70-0,75 см3/г,а константы диффузии — 106-108 см2/с.Максимум поглощения белков в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматич.аминокислот, находится вблизи 280 им. Возбуждение электронов атома азотапептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при 185-240 нм.В ИК-области спектра белки поглощают за счет СО- и NH-rpyпп при 1600 и 3100-3300см-1.

В р-рах белки амфотерны. Изоэлектрич. точки белков могут иметь значения от< 1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома с) и выше. Боковые группы аминокислотныхостатков способны вступать во многие р-ции. Белки дают ряд цветных р-ций,обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или хим. группировок.К важнейшим из них относятся: биуретовая реакция (пептидные связи),ксантопротеиноваяреакция (ароматич. ядра остатков тирозина, триптофана, фенилаланина),Адамкевича реакция (индольное кольцо триптофана),Мил лона реакция(фенольный радикал тирозина), Паули реакция(имидазольное кольцогистидина), Сакагучи реакция (гуанидиновая группа аргинина) и нингидриноваяреакция (аминогруппа).

Выделение. Один из первых этапов выделения белков — получение соответствующихорганелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощьюдифференциального центрифугирования. Далее белки переводят в растворимое состояниепутем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда — неполярнымир-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно(NH4)2SO4], этанолом, ацетоном или путемизменения рН, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работупроводят при пониж. т-ре (ок. 4°С); с целью исключения протеолиза используютингибиторы протеаз, нек-рые белки стабилизируют полиолами, напр. глицерином.Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельныхбелков или группы гомологичных белков: наиб. распространенные методы разделения-гель-проникающаяхроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография; эффективные методы-жидкостнаяхроматография высокого разрешения и аффинная хроматография.

Критерий чистоты белков — гомогенность при электрофорезе, хроматографиии ультрацентрифугировании. Одноцепочечный белок должен быть гомогенным приN- и С-концевом анализе (см. ниже). Примесь сопутствующих ферментов определяютс помощью специфич. субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохим.методы (обычно до 10-3 мкг/мл примесного антигена).

Методы исследования первичной структуры. Знание первичной структурыбелка-основа для определения его вторичной и третичной структур, выяснениярасположения функц. групп в активном центре белка и построения модели егофункционирования. Исследование первичной структуры мутантных белков позволяетна молекулярном уровне характеризовать различия между штаммами микроорганизмов,фагов и вирусов, выяснять молекулярные причины генетич. болезней. Данныепо первичной структуре используют при установлении и проверке таксономич.взаимоотношений между разл. видами живых организмов, построении фило-генетич.древа и анализе хода биол. эволюции.

Для определения аминокислотной последовательности белка прежде всего разделяютего полипептидные цепи (если макромолекула состоит из неск. цепей). Затемопределяют аминокислотный состав цепей, N- и С-концевые аминокислотныеостатки и аминокислотные последовательности. Полипептидные цепи подвергаютспецифич. расщеплению протеолитич. ферментами или хим. реагентами. Смесьобразовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотныйсостав и аминокислотную последовательность. При необходимости крупные фрагментыдополнительно расщепляют к.-л. способом на более мелкие. Порядок расположенияфрагментов выясняют путем расщепления молекулы белка по др. связям и анализаобразующихся при этом "перекрывающихся" фрагментов.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемогобелка или пептида и количеств. определение всех аминокислот в гидролизате.Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный р-р НС1, а при анализе содержаниятриптофана — 4 н. метансульфоновую к-ту, содержащую 0,2% 3-(2-аминоэтил)индола,или кипячение со щелочью. Количеств. определение аминокислот в гидролизатепроводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборовсмесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляютспектрофотометрически по р-ции с нингидрином или флуориметрически с использованиемфлуорескамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можноанализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты.

Наиб. распространение для определения N-концевых остатков находит дансильныйметод. Его первая стадия -присоединение дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида)к непротонированной/images/enc2/002395.jpgаминогруппес образованием дансилпептида (ДНС-пептида). Затем последний гидролизуют5,7 н. р-ром НС1 при 105 °С, в результате чего освобождается N-концевая/images/enc2/002396.jpgДНС-аминокислота,к-рая обладает интенсивной флуоресценцией в УФ-области спектра; для ееидентификации достаточно 0,1-0,5 нмоля в-ва.

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативныйгидролиз карбоксипептидазами, к-рые специфически расщепляют пептидные связи,образованные С-концевыми остатками. Поскольку после отщепления концевыхостатков фермент атакует послед. пептидные связи, измерение скорости отщепленияотдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотнуюпоследовательность.

Важнейший этап в определении первичной структуры белка — расщепление макромолекулына пептидные фрагменты. Среди ферментативных методов расщепления наиб.широко используется гидролиз трипсином. Трипсин обладает уникальной субстратнойспецифичностью: гидролизует исключительно связи, образованные карбоксильнымигруппами осн. аминокислот — лизина и аргинина. Введение заместителей вбоковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу по остаткам модифициров.аминокислот и позволяет гидролизовать макромолекулы избирательно толькопо остаткам аргинина или лизина. Особенно часто используется модификацияостатков лизина с послед. гидролизом белков по остаткам аргинина. Модифицирующиеагенты — ангидриды дикарбоновых к-т (янтарной, малеиновой и цитраконовой).Из др. протеолитич. ферментов широко применяется протеаза из Staphylococcusaureus (гидролизует связи, образованные карбоксильными группами остатковглутаминовой к-ты, а в нек-рых случаях и остатков аспарагиновой к-ты),а также химотрипсин и термолизин. Последние ферменты обладают более широкойспецифичностью. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованныхкарбоксильными группами ароматич. аминокислот — тирозина, фенилаланинаи триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются связи лейцина, метионинаи гистидина. Термолизин преим. расщепляет связи, образованные аминогруппойостатков с гидрофобной боковой цепью (изолейцин, лейцин, валин, фенилаланин,тирозин, триптофан).

Из химических методов расщепления белков наиболее специфичный и чаще всегоприменяемый -бромциановое расщепление по остаткам метионина (выход 90-100%):
/images/enc2/002397.jpg

Для расщепления белков по карбонильной группе остатка триптофана используютN-бромсукцинимид или более селективный 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол(BNPS-скатол) (выход Ю-50%):
/images/enc2/002398.jpg

Гидроксиламин расщепляет пептидные связи между остатками аспарагинаи глицина. При его взаимод. с циклич. имидом ангидроаспартилглицина, спонтаннообразующегося из аспарагинилглицина, в щелочной среде происходит расщеплениепептидной цепи с образованием смеси/images/enc2/002399.jpgи/images/enc2/002400.jpgаспартилгидроксаматов:
/images/enc2/002401.jpg

В ряде случаев для расщепления белков используется метод частичного кислотногогидролиза. наиб. чувствительны к действию к-т аспартильные пептидные связии особенно связь аспартил — пропил.

При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства,кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционированиясмесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков,в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах.Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофорезана бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля.

Осн. сложность при фракционировании молекул крупных пептидов (более20 аминокислотных остатков) — их св-во слипаться в водных р-рах друг сдругом с образованием высокомол. агрегатов, не поддающихся разделению.Для предотвращения агрегации в буферные р-ры вводят мочевину (до 8 М),гуанидинийхлорид (до 6 М) или детергенты (додецилсульфат Na); разделениечасто проводят с помощью гель-проникающей хроматографии и ионообменнойхроматографии. Эффективный метод разделения — жидкостная хроматографиявысокого разрешения на носителях с обращенной фазой. Для селективного выделенияпептидов, несущих химически активные группировки, м. б. использована хемоспецифич.(ковалентная) хроматография, основанная на образовании ковалентной связипептида с носителем. Напр., для выделения цистеинсодержащих пептидов используютр-цию тиол-дисульфидного обмена, с помощью к-рой пептиды через дисульфидныймостик присоединяются к модифицированному 2,2'-дипиридилдисульфидом носителю.Ковалентно связанные с носителем цистеинсодержащие пептиды м. б. легкоэлюированы при послед. обработке/images/enc2/002402.jpgмеркаптоэтанолом.

Осн. метод исследования аминокислотной последовательности пептидов ибелков — хим. деградация с помощью фенилизотиоцианата. Этот метод позволяетпоследовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов,к-рые абсорбируют свет в УФ-области с максимумом поглощения 265-270 нм.Для их идентификации наиб. часто используют тонкослойную хроматографию,жидкостную хроматографию высокого давления, а также масс-спектрометрию.Широкое применение нашел также метод, сочетающий последовательную деградациюпептида по Эдману (см. Эдмана деградация) с анализом N-концевыхаминокислотных остатков в виде их дансильных производных. Достоинство метода-его высокая чувствительность.

Для непосредственного анализа первичной структуры белков обычно используютсеквенатор — прибор, к-рый с высокой эффективностью осуществляет последовательноеавто-матич. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградациибелков по методу Эдмана. Все р-ции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике,вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4).Образец белка распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизацияпроцесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволилиподнять общий выход реакции до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора- белки и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотныхостатков; для таких соединений обычно удается определять последовательность30-35 (в ряде случаев 40-50) остатков. Для анализа коротких пептидов болееэффективен подход, заключающийся в их ковалентном присоединении к нерастворимомуносителю. Этот принцип положен в основу твердофазного секвенатора, гдереакц. "сосудом" служит хроматографич. колонка, с носителем к-рой ко валентносвязан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускают реагентыи р-рители. Носителями чаще всего служат полистирол и пористое стекло.В кач-ве функц. группы, реагирующей с пептидом, обычно используется алифатич.или ароматич. аминогруппа. Для присоединения к носителю пептидов, образующихсяв результате бромцианового расщепления, используют высокую реакц. способностьС-концевого лактона гомосерина. Лизинсодержащие пептиды м. б. присоединеныза счет/images/enc2/002403.jpgаминогруппыпутем конденсации с n-фенилендиизотиоцианатом. Остальные пептиды присоединяютпо С-концевой карбоксильной группе карбодиимидным методом. Третье поколениеприборов — газофазные секвенаторы, в к-рых образец наносится на небольшой(диаметр ок. 5 мм) диск из пористого стеклянного волокна, а все реагентыподаются в газовой фазе. Таким способом анализируют микроколичество в-ва( < 100 пкмоль).
/images/enc2/002404.jpg

Рис. 4. Схема реакц. камеры секвенатора.

При определении аминокислотной последовательности пептидов находит применениетакже масс-спектрометрия. В этом случае используется способность ионизиров.молекул пептидов распадаться по т. наз. аминокислотному типу фрагментации,заключающемуся в разрыве СО—NH или/images/enc2/002405.jpg—СО связей:
/images/enc2/002406.jpg

Идентификация в масс-спектре пиков, соответствующих фрагментам А1...Апилиа1...ап, дает информацию о строении пептида.

Наиб. сложные проблемы возникают при изучении первичной структуры мембранныхбелков, а также белков, выделяемых в ничтожно малых кол-вах или имеющих большуюмол. массу (> 100000). Ряд этих проблем решен благодаря разработке быстрыхи эффективных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК. Посколькупервичная структура любого белка закодирована в нуклеотидной последовательностисоответствующего ей участка ДНК, то определение последней позволяет с помощьюгенетич. кода автоматически устанавливать и соответствующую аминокислотнуюпоследовательность. При этом оказалось особенно эффективным параллельноеизучение первичных структур белков и ДНК. Такой подход резко ускоряет проведениеисследований и значительно повышает достоверность результатов.

Методы изучения пространственной структуры. При изучении пространств.структуры белков существует два принципиальных подхода: исследование в р-реи в кристаллич. состоянии. Осн. метод, дающий непосредственную информациюо пространств. расположении атомов в молекуле белка, — рентгеноструктурныйанализ. Он применим только для хорошо кристаллизующихся белков. При этом нарядус кристаллом нативного белка необходимо получать производные, содержащие тяжелыеатомы, к-рые были бы изоморфными исходному белку, т.е. давали бы подобныекристаллич. структуры. Тяжелый атом вводится в молекулу белка при "вымачивании"кристалла в соответствующем р-ре или в процессе кристаллизации. Иногдаиспользуют хим. модификацию белка, напр. n-хлормеркурийбензоатом по SH-группам.

Интерпретация карт электронной плотности молекулы значительно облегчаетсяпри знании аминокислотной последовательности. Однако далеко не каждый белокудается получить в кристаллич. состоянии. Необходимое условие кристаллизации- сохранение нативной конформации, к-рая часто реализуется лишь в условиях,приближенных к физиологическим. В частности, белки, входящие в состав нуклеопротеидныхкомплексов (рибосома, вирусы), хорошо кристаллизуются только в составетаких комплексов. С помощью обычного рентгеновского излучения проводитьанализ таких гигантских образований сложно. В этих случаях используют синхротронноерентгеновское излучение, интенсивность к-рого может быть на два порядкавыше. Вследствие этого резко сокращается время эксперимента по регистрациидифракц. отражений, а также снижается кол-во исследуемого в-ва. Ряд мембранныхбелков кристаллизуется в условиях нативного липидного окружения с образованиемт. наз. "двухмерных" кристаллов, представляющих из себя регулярно упакованныемолекулы белков в бислойной лииидной мембране. При изучении двухмерных кристалловиспользуют электронную микроскопию и электронографию.

Во мн. случаях хорошие результаты получают, применяя нейтронографию.Нейтроны, имея низкую энергию, в отличие от рентгеновских лучей не разрушаюткристаллы белков, в результате чего можно получить полный набор дифракц. данныхот одного кристалла. С использованием этого метода удается локализоватьв структуре белка отдельные атомы водорода, а также расположение молекул кристаллизац.воды.

В общем случае конформация белка в кристалле может отличаться (обычно весьманезначительно) от конформации в р-ре. Поэтому наряду с исследованием кристалловпроводят изучение белка и в его прир. среде. Существует набор методов исследованияпространств. структуры белка в р-ре. наиб. часто используемые — оптич. методы(УФ-, ИК- и Раман-спектроскопия, круговой дихроизм, флуоресценция), ЯМРи ЭПР. Ни одним из этих методов в отдельности, как правило, невозможноопределить конформацию белка, тогда как их комбинация в ряде случаев даетинформацию, к-рая сравнима по ценности с рентгеноструктурным анализом.
/images/enc2/002407.jpg

Рис. 5. Расположение молекулы бактериородопсина в пурпурно" мембране.Участки полипептидной цепи, доступные для иодирования лактопероксидазой-L,протеолиза папаином-Р, химотрипсином-Ch и карбоксипептидазой А — СрА. А-антигенныедетерминанты.

Оптич. методы позволяют следить за изменениями конформации белка в процессефункционирования или при изменении окружающих условий. Комбинация этихметодов дает информацию об относит. содержании в белке элементов вторичнойструктуры, о расположении остатков триптофана относительно пов-сти белковойглобулы и о конфигурации связей С—S—S—С в дисульфидных мостиках.

Прямую информацию о пространств. строении белков в р-ре дает метод ЯМР.Совр. методики ЯМР-спектроскопии позволяют проводить практически полноеотнесение сигналов в спектрах пептидов и небольших белков (с мол. м. до 10.000)к определенным ядрам в молекуле. Использование гомоядерных (1Н—1H)и гетероядерных (*Н—13C) констант спин-спинового взаимод. даетвозможность определять торсионные углы/images/enc2/002408.jpgи/images/enc2/002409.jpg осн.полипептидной цепи и торсионный угол х' боковых цепей аминокислотных остатков.С помощью ядерного эффекта Оверхаузера, сдвиговых и уширяющих реагентов(ионы парамагн. металлов, спиновые метки) измеряют расстояния между отдельнымиядрами молекулы. Т. обр. для пептидов и небольших белков удается определитьпространств. структуру с разрешением до 0,3-0,4 нм. Несомненное достоинствоЯМР-спектроскопии — возможность получать информацию о динамике пространств.структуры молекулы белка.

Модификация белка реагентами, несущими своб. радикал (спиновая метка) илифлуоресцентную группировку, позволяет судить о хим. окружении модифицируемойгруппы, а при наличии в белке двух таких меток — измерить расстояние междуними.

Теоретически возможно предсказывать в общем виде пространств. строениебелка, исходя из его аминокислотной последовательности. Такого рода расчетыпроводят с помощью ЭВМ на основании закономерностей, выведенных в результатестатистич. обработки данных для белков с установленной пространств. структурой.В ряде случаев расчетные методы дают удовлетворительные результаты, к-рыепомогают интерпретировать данные, полученные др. методами.

При исследовании пространств. структуры белка часто используют ограниченныйпротеолиз, проводящийся в мягких неденатурирующих условиях, в к-рых гидролизуютсяисключительно пептидные связи, находящиеся на пов-сти глобулы белка. Такимпутем получают информацию о доменной структуре белка. В случае мембранных белковэтим методом удается различить участки полипептидной цепи, расположенныевнутри мембраны и на ее пов-сти (рис. 5). Аналогичную по характеру, нозначительно более детальную информацию получают при изучении взаимод. белкови их отдельных фрагментов с антителами.

Синтез. Биосинтез белков происходит в результате трансляции всубклеточных частицах — рибосомах, представляющих собой сложныйрибонуклеопротеидный комплекс. Информация о первичной структуре белка "хранится"в соответствующих генах — участках ДНК — в виде последовательности нуклеотидов.В процессе транскрипции эта информация с помощью фермента — ДНК-зависимойРНК-полимеразы — передается на матричную рибонуклеиновую к-ту, к-рая, соединяясьс рибосомой, служит матрицей для синтеза белка. Выходящие из рибосомы синтезированныеполипептидные цепи, самопроизвольно сворачиваясь, принимают присущую данномубелку конформацию, а также подвергаются модификации благодаря р-циям разл.функциональных групп аминокислотных остатков и расщеплению пептидных связей(см. Модификация белков).

Хим. синтез широко применяют для получения пептидов, в т.ч. биологическиактивных гормонов и их разнообразных аналогов, используемых для изучениявзаимосвязи структуры и биол. функции, а также пептидов, несущих антигенныедетерминанты разл. белков и применяемых для приготовления соответствующих вакцин.Первые хим. синтезы белков в 60-е гг. (инсулина овцы и рибонуклеазы SX осуществленныев р-ре с помощью тех же методов, к-рые используют при синтезе пептидов,были связаны с чрезвычайно большими сложностями. В каждом случае требовалосьпровести сотни хим. р-ций и окончательный выход белков был очень низок (менее0,1%), в результате чего полученные препараты не удалось очистить. Позжебыли синтезированы нек-рые химически чистые белки, в частности инсулин человека(П. Зибер и др.) и нейротоксин II из ядра среднеазиатской кобры (В. Т.Иванов). Однако до сих пор хим. синтез белков представляет весьма сложную проблемуи имеет скорее теоретич., чем практич. значение. Более перспективны методыгенетическойинженерии, к-рые позволяют наладить пром. получение практически важныхбелков и пептидов.

Значение белков в питании. Белки-необходимая составная часть продуктовпитания. Проблема пищевого белка стоит очень остро. По данным Международнойорганизации по продовольствию и с. х-ву при ООН больше половины человечестване получает с пищей необходимого кол-ва белков. Недостаток белков в пище вызываеттяжелое заболевание — квашиоркор.

В процессе пищеварения белки подвергаются гидролизу до аминокислот, к-рыеи всасываются в кровь. Пищ ценность белков зависит от их аминокислотного состава,содержания в них т. наз. незаменимых аминокислот, не синтезирующихся ворганизмах (для человека незаменимы триптофан, лейцин, изолейцин, валин,треонин, лизин, метионин и фенилаланин). В питательном отношении растит.белки менее ценны. чем животные; они беднее лизином, метионином и триптофаном,труднее перевариваются. Один из путей решения проблемы — добавление в растит.пищу синтетич. аминокислот. Наряду с этим выводят новые сорта растений,содержащие гены, ответственные за синтез недостающих аминокислот. Перспективноиспользование для этого методов генетич. инженерии. Чрезвычайно важноезначение имеет широкое внедрение пром. микробиологического синтеза,напр. выращивание дрожжей на гидролизном этиловом спирте, прир. газеили нефти. Получаемые при этом белково-витаминные концентраты (БВК) используютв качестве добавок к корму с.-х. животных. Исследования советских микробиологови технологов (Г. К. Скрябин и др.) послужили основой для производства БВКв СССР в крупных масштабах.


===
Исп. литература для статьи «БЕЛКИ»: Бэйли Дж., Методы химии белков, пер. с англ., М., 1965; Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков, пер. с англ.. М.,1974; Дэвени Т., Гергей Я., Аминокислоты, пептиды и белки, пер. с англ.,М., 1976; Ш а м ин А. Н., История химии белка, М., 1977; У айт А. [и др.],Основы биохимии, т. 1-3, пер. с англ., М., 1981; Лени нджер А., Основыбиохимии, т. 1-3, пер. с англ., М., 1975; Я кубке Х.-Д., Ешкайт X., Аминокислоты,пептиды, белки, пер. с нем., М 1985; Advances in protein chemistry, v.1-33, N.Y., 1944-79; Methods in enzymology, v. 11. ed. by S. P. Cofowick,N.O. Kaplan, N.Y.-L, 1967; то же, v. 25, pt B, ed. by C.H.W. Hirs, S. N.TimashefT, N.Y.-L., 1972; Protein sequence determination. A sourcebookof methods and techniques, ed. by S. B. Needleman, 2 ed.. В., 1975; Theproteins, ed. by H. Neurath, R.L. Hill, 3 ed., 1-4, N. Y.-[a.o.], 1975-79;Methods in protein sequence analysis, ed. by M. Elzinga. Clifton, 1982.Ю.А. Овчинников.

Страница «БЕЛКИ» подготовлена по материалам химической энциклопедии.